Nature Medicine免疫原性機制深度研究：單一T細胞表位引起的嚴重中和抗體

文章轉載自公眾號  佰傲谷BioValley ， 作者 Eastwood

近日，瑞士提契諾大學與賽諾菲研發人員等在最新一期的《Nature Medicine》上發表了重要研究成果：Natalizumab單一T細胞表位促使多發性硬化癥患者產生嚴重的中和抗體。文章的研究發現以嚴密充分的證據再次證實，T細胞表位是引起B細胞反應（此文中同時重點研究了中和性抗體）的主要原因，深化了對于免疫原性發生機制的認識。

Natalizumab：6%中和抗體發生率

Natalizumab是一種靶向α4整合素的IgG4型抗體，最早由Elan公司開發，后授權給Biogen公司。2004年獲得FDA批準上市，商品名為Tysabri，用于治療多發性硬化癥，2018年銷售額18.6億美元。根據臨床數據，使用Natalizumab的患者有6%會產生中和抗體，導致治療無法繼續。為探究ADA以及中和性ADA產生機制，研究人員選取2名使用Natalizumab的患者，對其B細胞、T細胞響應進行了深入研究。

研究人員選取了2名產生強中和性抗體的多發性硬化癥患者，分離了特異性結合Natalizumab的記憶B細胞、記憶T細胞。從A、B兩位患者分離的B細胞上清中分別獲得30個、10個單抗。A患者的單抗與natalizumab的親和力更高，平均6.1pM，B患者為2.3nM。A患者中60%（18/30）的單抗為中和性抗體，即對Natalizumab結合α4整合素的IC90小于1000ng/ml；B患者則未見中和性抗體，可能與分離的單抗數目少有關

附表 2名患者分離的單抗

研究人員構建了Natalizumab的64個突變體（6個CDR的替換突變組合），來研究A、B患者這些單抗識別Natalizumab的哪些CDR區。結果發現Natalizumab誘導產生的抗藥抗體識別多個表位，并且聚焦于重鏈的CDR區。同時也發現，BAb（結合抗體，非中和抗體）相比NAb，VDJ的體細胞突變程度更低一些。

中和抗體與非中和抗體的區別：表位不同、親和力不同還是結合解離曲線性質有差異？

從上述Natalizumab CDR替換突變來看，BAb與NAb沒有呈現出不同的集中傾向，提示兩者并非是表位不同。從結合解離的動力學曲線來看，BAb與NAb則呈現出完全不同的性質：兩者的結合常數Ka相當，但解離常數Kd則NAb明顯更低，說明中和抗體NAb與Natalizumab結合后解離明顯更慢。

以中和抗體NAA84和結合抗體NAA32為代表，兩者與Natalizumab的結合解離曲線如下。

體細胞突變對于中和抗體的產生至關重要

對于體細胞突變的作用，研究人員將單抗親和力（EC50）與中和效應（IC90）與未經體細胞突變的UCA進行比較，發現中和抗體NAb相對于非中和抗體BAb，其UCA已經具有很高的親和力，但需要經過體細胞突變，才能獲得完全的中和效應。證明體細胞突變對于中和抗體的產生具有至關重要的意義。

接下來研究人員進行了結構生物學分析，分別獲得了NAA84-NZM復合物和NAA32-NZM復合物的晶體結構。NAA84、NAA32分別識別NZM（Natalizumab）的22個和18個氨基酸，且其中14個氨基酸重合（13個與α4整合素的結合位點重合）。從結合面來看，NAA84與NZM結合的面積為617A2，NAA32與NZM結合的面積為757A2，但NAA84與NZM的結合更緊密。結構信息說明中和抗體與非中和抗體的主要差異不應是表位差異，而是結合強度/契合度的差異。

T細胞表位誘導中和抗體的產生

從理論上來說，體細胞突變是由CD4 T細胞識別NZM idiotype的非自身抗原而驅動的。為了驗證這一假設，研究人員分離了NZM特異性的T細胞，A患者獲得了12個克隆，B患者獲得了54個克隆。

TCR-Vβ基因測序顯示A、B分別有5個和至少7個基因型，驚人的結果是幾乎所有這些T細胞都識別NZM輕鏈FR2和CDR2重合的2段多肽：GKAPRLLIHYTSALQPGI，作為為其命名為NZM-LCFR2-CDR2。值得注意的是，對NZM-LCFR2-CDR2的識別，A患者限定在HLA-DRB1*14/16，B患者限定在DRB1*07/07。上述結果說明，單一T細胞表位NZM-LCFR2-CDR2足以導致針對NAM idiotype產生很強的多克隆B細胞反應。

接下來，研究人員用NZM刺激NZM特異性B細胞，利用質譜分析MHC-II結合的多肽，發現三組多肽。其中兩組位于FR3、FR4-CH1，與人germline一致，理論上不會產生引起免疫反應。驚奇的是，第三組位于FR2-CDR2，TPGKAPRLLIHYTSALQPGIPSR，涵蓋了前述的NZM-LCFR2-CDR2。同時，研究人員用軟件對NZM輕鏈、重鏈完整序列以15mer多肽來預測其與不同MHC-II基因型的結合，發現NZM-LCFR2-CDR2的免疫原性具有更廣泛的HLA基因背景，即可能對多種MHC-II基因型起作用?？傊?，這些證據說明NZM-LCFR2-CDR2是NZM唯一的T細胞表位，并能導致產生抗藥抗體乃至中和抗體。

去除Natalizumab免疫原性的嘗試

綜合前述的發現，研究人員開始嘗試去除NZM的免疫原性。具體做法是對NZM-LCFR2-CDR2中不參與α4整合素結合的氨基酸，進行突變以去除免疫原性，同時保證構象盡量不影響α4整合素的結合。

研究人員構建了5個NZM突變體，序列如下圖，其中第五個突變體為對應的Germline序列。結果var1、var3保持了抗原親和力，var2、var4則部分失去康源親和力，var5徹底失去抗原親和力。效果非常明顯地，5個突變體均失去NZM-LCFR2-CDR2特異性T細胞的能力。軟件分析發現，var1、var3對其他MHC-II基因型的親和力也明顯下降。這說明，去免疫原性的NZM有進行體內實驗的價值。

總結

T-B細胞相互作用，對于B細胞活化產生抗體的機制已經屬于共識。學術界和工業屆也普遍以T細胞表位改造作為去除治療性蛋白藥物免疫原性的主要手段。一般是結合MHC-II結合、基于PBMC的激活以分析和驗證T細胞表位。本文通過大量充分、有效的工作，證實了T細胞表位通過促進體細胞突變，產生親和力更強的抗藥抗體，乃至于進一步突變減小抗藥抗體與抗體藥物的解離常數，有效阻止抗體與抗原的結合即產生中和抗體的機制。

此外，Natalizumab作為人源化抗體，FR區和恒定區已經不存在T細胞表位。而臨床上存在的小比例中和抗體患者，說明抗體存在較少乃至單一的T細胞表位。巧妙的選擇，以及完備的實驗方法，第一次詳盡、完美的論證了T細胞表位導致ADA和中和性ADA的機制。