Erenumab之發現：首個GPCR抗體藥物的開發 2019-09-12 admin 摘自：Armstrong 生物制藥小編 GPCR作為重要的藥物靶點，卻一度成為抗體藥物的禁區。由于GPCR為七次跨膜蛋白，結構穩定性高度依賴于脂質雙分子層，難于獲得可溶的、結構精確的游離抗原。膜聯形式的GPCR雖然可以作為抗原，但其抗原性卻往往不如人意，無法獲得足夠的抗體用于后續篩選。 ▲CGRP與偏頭痛2018年5月17日，FDA批準安進的CGRP抗體Erenumab，商品名為Aimovig，用于成人偏頭痛的預防治療。Erenumab由此成為首個獲批上市的GPCR抗體，成為抗體藥物發展史上的里程碑事件。CGRP受體抗體的設計標準CGRP-R是由兩個結構域組成的異源二聚體：降鈣素受體樣受體（CLR）和受體活性修飾蛋白1（RAMP1）。CGRP-R與腎上腺髓質素（AM）受體、淀粉纖維素（AMY）受體高度相關。三者的結構域類似，如AM1受體由CLR+RAMP1組成，AM2受體由CLR+RAMP3組成，AMY受體則由CTR+RAMP1組成。參與偏頭痛發病機制的只有CGRP受體，而無AM受體、AMY受體。 ▲CGRP受體與AM受體、AMY受體的對比CGRP的C端與CLR-RAMP1胞外區（ECD）末端高親和力相互結合，CGRP的N端則通過與CLR異源二聚體跨膜α螺旋相互作用發揮激動劑效應。根據上述特征，CGRP受體抗體的篩選應注意挑選結合表位同時涵蓋CLR與RAMP1結構域，這樣可以避免與AM受體、AMY受體的非特異性相互作用。▲CGRP與CGRP受體的結合位點需要注意的是，CGRP與CGRP受體的親和力在15pM左右，意味著篩選的CGRP受體抗體與CGRP受體的親和力至少也在pM級別。因此，CGRP受體抗原的篩選應注意表位的設計，以提高特異性，并通過大規模篩選獲得足夠高親和力的抗體侯選物。基于表位的抗原設計針對前述考慮，徐岑等設計的全新抗原：共表達CLR的胞外區（ECD）和RAMP1的胞外區（ECD），分別將兩者融合到用于穩定結構的Fc上，Fc與ECD之間有Linker存在以保證ECD無空間位阻限制，可以自發形成正確的空間構象。這一步類似于雙特異性抗體的表達，隨后純化中根據分子量大小可以分離異源二聚體（下圖B中的peak 2）。表達純化后通過重組抗原對于CGRP與高表達CGRP受體細胞系的結合，證明CGRPR-ECD-Fc可以與CGRP受體競爭性地結合CGRP，表明抗原設計有效。 在抗體篩選過程，同時使用該新抗原與膜聯CGRP受體作為免疫原免疫轉基因小鼠，以進行全人源抗體的篩選。抗體發現過程抗體篩選使用的是原Abgenix的XenoMouse轉基因小鼠。2006年安進以22億美元的價格收購了Abgenix，擁有了自己的全人源抗體發現技術平臺。該平臺先后獲批了6款全人源抗體：RANK抗體Prolia/Xgeva、PCSK9抗體藥物Repatha、IL-17受體抗體藥物Siliq、PD-L1抗體Imfinzi、CGRP抗體Aimovig等。篩選過程：§ CGRP-R高表達細胞用于篩選抗體與CGRP-R的結合：§ 反向篩選去除與AM受體結合的抗體；§ 建立CGRP信號通路主要二級信使cAMP檢測的細胞學方法，以對1nM誘導cAMP產生的抑制率為評價標準。使用CGRPR-ECD-Fc抗原免疫XenoMouse，產生10萬個可以結合CGRP-R的單克隆，反向篩選后還有1092個克隆可以特異性結合CGRP受體而不結合AM受體，其中28%的克隆對cAMP的抑制超過50%。 使用膜聯CGRP-R作為抗原，篩選效率則遠低于CGRPR-ECD-Fc。10萬個結合CGRPR的克隆中，僅有119個特異性結合CGRP受體。119個克隆中僅有2.5%對cAMP的抑制超過50%。篩選結果再次說明基于CGRP受體獨特表位設計的新抗原，對于篩選特異性的CGRP受抗體至關重要。接下來，對于cAMP抑制超過70%的167個克?。ń^大部分來自于新抗原組），檢測其與AM受體和AMY受體的結合，大部分克隆均不結合，說明對CGRP受體的特異性較好。通過對單克隆上清的高通量篩選，結果4個具有代表性的、序列獨特性的單抗，與CGRP受體的親和力均在pM級別，cAMP檢測的IC50均在1.2-1.8nM級別，對其他受體AM受體、AMY受體則無效應。 最后，作者對抗體結合CGRP受體同時依賴于CLR、RAMP1異源二聚體的推論進行了進一步的驗證。先用AspN蛋白酶切CGRPR-ECD-Fc，做肽圖，然后再由CGRP-R抗體存在情況下切CGRPR-ECD-Fc。通過質譜分析比較肽圖的變化，確定CGRP-R抗體的結合位點。 結果發現位于CLR的C5、C6、C7等肽段，位于RAMP1的R1、R2等肽段明顯減少，說明抗體結合表位同時包括CLR和RAMP1結構域，也證實抗原設計的思路達到了預期效果。
